Вы уже запомнили, что означает CRISPR – сгруппированные короткие палиндромные повторы с регулярными промежутками? Что ж, теперь вы можете добавить MOBE в редактор ортогональных баз с мультиплексированием списков. Редакторы оснований не новы, это, по сути, ферменты, которые заменяют одно основание – C (цитозин), T (тимин), G (гуанин), A (аденозин) – в ДНК на другое, таким образом, C превращается в T или G превращается в A. MOBE — это управляемая система для внесение нескольких желаемых базовых изменений одновременно.
Это система, дополняющая CRISPR, которая нацелена на последовательность ДНК, а затем использует Cas9 или аналогичную полезную нагрузку для создания двухцепочечного разреза в ДНК. Затем можно использовать естественную систему восстановления клеток для внесения изменений в процессе восстановления, таких как введение новой генетической последовательности. Таким образом, CRISPR может выполнять целенаправленную вставку или удаление генов, уничтожать целевые типы клеток или отключать гены и снова включать их.
MOBE не может вставлять целые гены. Системы, подобные этой, могут вносить изменения в одну базу данных. Что нового в системе MOBE, так это то, что она может вносить несколько различных типов изменений одновременно. Некоторые базовые изменения могут изменить природу получаемого белка. Многие изменения отдельных оснований в ДНК являются “бесшумными”, что означает, что они не изменяют полученную аминокислоту, которая кодируется, поскольку каждая аминокислота имеет 3-4 одинаковых кода из трех пар оснований. Также возможно, что мутация одного основания изменит кодируемую аминокислоту, но новая аминокислота структурно похожа на предыдущую, поэтому конформационные изменения в белке не происходят. Но некоторые точечные мутации заменяют одну аминокислоту на другую с другим эффектом – например, превращают прямую линию в излом. Они изменяют трехмерную структуру белка и, следовательно, его функцию. Некоторые точечные мутации могут также изменять код на так называемый стоп-кодон, прекращая производство белка в этой точке и резко изменяя его структуру.
Это является основой для многих генетических заболеваний, они являются точечными мутациями. Некоторые из них могут быть результатом единичной точечной мутации, в то время как другие являются результатом комбинации точечных мутаций. Основная цель MOBE — изменить клеточную линию в культуре с помощью множества различных, но специфичных точечных мутаций для моделирования генетического заболевания. Это позволяет создавать биологические модели этих генетических заболеваний по запросу и, следовательно, является преимуществом для исследований.
Система использует направляющую РНК для определения нужного участка ДНК. Они объединяют их с РНК-аптамерами, которые представляют собой небольшие петли РНК, которые связываются со специфическими белками и, следовательно, могут рекрутировать их. Они используют аптамеры, которые задействуют ферменты, производящие специфические изменения оснований – ABEs (редакторы оснований аденозина) в сочетании с CBEs (редакторы оснований цитозина). Направляющие РНК определяют, где внести изменения, а аптамеры определяют, какие изменения внести.
Основное преимущество системы MOBE перед простым выполнением нескольких отдельных базовых изменений заключается в том, что эта система уменьшает “перекрестные помехи”, которые возникают при внесении базовых изменений в нежелательных местах. В результате внесения отдельных изменений возникают перекрестные помехи примерно в 30% случаев. С MOBE этот показатель снижается примерно до 5%, в то время как вероятность успешного внесения желаемых изменений составляет 30%. Это более эффективная и точная система, чем та, что используется в настоящее время.
Основная цель MOBE — научные исследования, и такой уровень эффективности вполне подходит для проведения генетических исследований клеток в культуре. Но, конечно, для любой системы редактирования генов всегда возникает вопрос – можно ли ее использовать в терапевтических целях? Например, теперь у нас есть первые одобренные FDA препараты CRISPR для лечения серповидноклеточной анемии и талассемии. Достаточно ли точен MOBE для терапевтического вмешательства? Это еще предстоит определить, как и связанный с этим вопрос: насколько велик потенциал для повышения точности MOBE? Какого порогового значения нам нужно достичь, чтобы преимущества перевешивали риски? Это, вероятно, зависит от области применения.
Как я уже отмечал в связанном посте, серповидноклеточная анемия и талассемия — это самые низкие показатели для терапевтического редактирования генов. Это происходит потому, что мы можем взять клетки у пациента (из костного мозга), затем обработать их с помощью CRISPR, убедиться, что у нас есть жизнеспособные здоровые клетки, а затем пересадить их обратно пациенту. Теоретически MOBE может быть использован аналогичным образом, когда требуется одна или несколько точечных мутаций для коррекции или компенсации генетического заболевания.
Теоретически эти инструменты для редактирования генов также могут быть использованы для оплодотворения яйцеклеток in vitro. Эмбрионы-кандидаты от родителей, у которых у одного или обоих было выявлено тяжелое генетическое заболевание или они являются носителями, могут быть обработаны перед имплантацией. Это может предотвратить передачу заболевания ребенку или даже просто гарантировать, что они не являются носителями. Генная терапия эмбрионов In vitro займет гораздо больше времени не потому, что ее сложнее проводить, а потому, что при этом повышается риск возникновения нежелательных перекрестных помех. При изменении клеток костного мозга эти изменения затрагивают только одного пациента. Но когда в геном эмбриона вносятся изменения, это влияет на всего человека и может передаваться будущим поколениям. Таким образом, эти изменения затрагивают генофонд человека, а не только отдельного человека. Это требует гораздо более высокого уровня тестирования на безопасность.
Третий тип применения — это применение к соматическим клеткам живых людей, а не к эмбрионам, и не к клеткам, которые могут быть удалены из организма. Задача здесь заключается в том, чтобы использовать инструмент для редактирования генов (CRISPR или MOBE) для желаемой популяции клеток. Допустим, вы хотите отредактировать мышечные клетки для лечения мышечной дистрофии. Как вы можете использовать инструмент для редактирования генов в достаточном количестве мышечных клеток, чтобы добиться клинического эффекта? Сейчас мы используем в основном вирусные векторы, которые эффективны, но рискованны. Многие вирусы эволюционировали таким образом, чтобы заражать определенный тип клеток и доставлять свою собственную генетическую нагрузку. Таким образом, мы можем выбирать и изменять конкретные вирусы, нацеливаясь на нужные нам клетки, и доставлять свою собственную полезную нагрузку, такую как CRISPR. Проблема в том, что вирусы имеют неприятную привычку вызывать инфекции – они не всегда послушные «работнички».
В последнее время были достигнуты успехи в технологии переносчиков вирусов. Они работают, и есть потенциал для дальнейшего развития. Пока еще трудно предсказать, сколько времени пройдет, прежде чем мы получим одобренную терапию на основе вирусных переносчиков (с использованием CRISPR или чего-то еще, возможно, MOBE) для лечения генетических заболеваний. Проводится много исследований, но доказать безопасность — это высокая планка.
Исследования продвигаются быстрыми темпами. По-прежнему кажется, что мы находимся на крутом подъеме, когда речь заходит о генетических технологиях. Значительные успехи достигаются быстрыми темпами, и MOBE — всего лишь еще один пример этого прогресса.
